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UV1901PC紫外可見分光光度計測二羥基丙酮含量
更新時間:2017-06-05 點擊次數(shù):3201

UV1901PC紫外可見分光光度計測二羥基丙酮含量

二羥基丙酮(1,3-dihydroxyaceton簡稱DHA,1)是一種天然存在的酮糖,具有生物可降解性,對人體和環(huán)境無毒害,可食用。1是一種重要的醫(yī)藥中間體也可作為一種抗病毒試劑 [1]。1能與皮膚zui上層物質(zhì)如角質(zhì)層內(nèi)的氨基酸發(fā)生Maillard反應使皮膚達到棕色到深色的染色效果。根據(jù)這一原理1在臨床上被廣泛應用于治療白癲風[2],它也被用來做為混合型卟啉病的保護劑[3]。還有研究表明在紫外照射下1能延緩皮膚癌變[4]

1的生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法和化學合成,國外比較成熟的工業(yè)生產(chǎn)主要是用含有甘油脫氫酶的微生物甘油底物發(fā)酵生產(chǎn)。目前,發(fā)酵液中1檢測方法有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]薄層層析法[7]。氣相色譜法測定時1不能直接汽化需要進行衍生化,操作繁瑣;液相也比較耗時。薄層層析法只能定性分析,無法定量。在酸性溶液中1的酮基與二苯胺(diphenylamine,2)的氨基發(fā)生反應生成藍色復合物,在608 nm處吸光度與1的濃度呈線性關系酸性條件下,2不與甘油發(fā)生反應。

 

 

1 2分光光度法反應原理

 

1  儀器與試劑

UV1901PC紫外可見光分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)

1Bio Basic公司;2(上海試劑三廠);無水乙酸;濃硫酸甘油;酵母粉;磷酸二氫鉀。

菌種:葡糖桿菌Gluconobacter sp. HD 410,河南大學生物工程研究所篩選并保藏。發(fā)酵培養(yǎng)基成分:甘油10%,酵母粉1.5%,無水KH2PO0.5%,pH自然。

2  方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

1溶液準確稱取1 1 g,1000 ml容量瓶中定容,制成1 g/l 母液,分別加蒸餾水配制成0、0.10.15、0.20.25、0.30.35、0.40.45、0.5 g/l1梯度溶液。

2溶液:準確稱取2 0.6 g,量取無水乙酸54 ml邊攪拌邊加入濃硫酸 6 ml,混勻后加入稱取的2,至*溶解后密封保存。

2.2  2分光光度法測定1

標準曲線繪制:分別0.5 ml 1梯度溶液,4.5 ml 2溶液,于比色管中水浴14 min,流水冷卻。以不含1溶液為空白參比,UV1901PC紫外可見分光光度計608 nm測樣品的吸光值。每個樣品三次重復,取平均值。

2.3發(fā)酵液1含量測定:取對數(shù)期種子,按5%的接種量接入搖瓶。200 r/min28°C發(fā)酵3~4 d,取發(fā)酵液1.5 ml,8000 g離心10 min。取上清液0.5 ml用蒸餾水稀釋100倍,取0.5 ml稀釋液加入4.5 ml 2溶液,水浴14 min,流水冷卻。以未接種發(fā)酵液為空白,在608 nm處測吸光值,根據(jù)標準曲線計算發(fā)酵液中1含量。

2.4 甘油濃度測定

用高碘酸氧化法[8]測發(fā)酵液中甘油的含量。

2.5 測定條件研究

2.5.1 測定波長的選擇

2.2方法蒸餾水為空白參比掃描不同1濃度400700 nm的吸收光譜。每個樣品三次重復。

是保持同樣的的2溶液濃度,改變1濃度得到的一系列吸收光譜。從圖2中可以看出,608 nm波長處顯色反應有zui大吸收值,且吸光度的增加與1溶液濃度的增加成正比。盡管405 nm波長處顯色反應也有吸收峰,但峰值較低,因而本法zui終選擇測定波長608 nm (OD608)

 

2不同1濃度吸收光譜

2.5.2 顯色劑用量的選擇

0.2 g/l 10.5 ml,分別加入含不濃度的2溶液,顯色反應后流水冷卻,測定吸光度OD608。由圖3A得出結(jié)論,2含量1%w/v吸光值不再增加用量過少導致1不能充分反應,所測結(jié)果比實際偏低,故本法zui終選擇的顯色劑用量為1%w/v

 A不同濃度2對吸光值的影響;  B不同濃度硫酸含量對吸光值的影響;

C不同溫度對吸光度的影響;    D反應時間對吸光值的影響

2.5.3 硫酸用量的確定

酸性條件1才能與2結(jié)合,生成藍色的復合物。由圖3B得出結(jié)論,濃硫酸含量為10%時生成的藍色復合物吸光值達到zui大。濃硫酸加入量不足或過多均導致吸光值偏低,且硫酸加入量過多會使反應冷卻后吸光值不穩(wěn)定。

2.5.4 加熱溫度的選擇

常溫下21反應很慢,3C表明,在沸水浴條件下,生成的復合物吸光值zui大,用冷水冷卻后吸光值穩(wěn)定。

2.5.5 加熱時間的選擇

沸水浴條件下反應需一定的時間1才能與2充分反應3D表明,水浴14 min后,吸光值zui大,且吸光值穩(wěn)定,有利于準確測定;隨著加熱時間的增加,吸光值略有降低,冷卻后吸光值不穩(wěn)定。因而,本法選用的沸水浴時間為14 min。

2.6  測定方法的影響因素

2.6.1   顯色穩(wěn)定時間的選擇

不同濃度1液與顯色劑反應后,在不同時間測定吸光值,試樣溶液在顯色完成至12 h內(nèi)吸光值穩(wěn)定,表明本方法顯色穩(wěn)定性良好。

2.6.2 相關影響因素研究

取發(fā)酵72 h的發(fā)酵液與未接種的培養(yǎng)基,8000 g離心10 min。取0.5 ml未接種培養(yǎng)基,以水為空白對照測吸光值,培養(yǎng)基在OD608值為0。結(jié)果說明甘油和培養(yǎng)基中的雜質(zhì)對該測定方法沒有影響。

量取1 ml離心上清液,加入4 ml無水乙醇[9],搖勻,離心后吸上清蒸餾水稀釋100倍,測其吸光值。與未加乙醇沉淀蛋白質(zhì)的發(fā)酵液相比,二者吸光值沒有顯著的差別。結(jié)果表菌體自溶產(chǎn)生的溶性蛋白對該檢測方法影響不大。

2.7  線性范圍及檢測限

2.2項下方法分別配制不同濃度的1溶液進行標準曲線繪制,結(jié)果表明1的濃度在0.5 g/l以內(nèi)時,吸光度A與質(zhì)量濃度c呈線性關系。1濃度為0.10.4 g/l時,0.2 OD608 0.8,回歸方程為A=0.00855+1.9095c (r2=0.999),線性良好。

2.8 精密度、回收率及準確度實驗

取發(fā)酵液待測樣品,按照10 g/l15 g/l的量精密加入1,按2.2項下方法反應后測定1的含量(重復測定五次),結(jié)果見表1所示,本方法平均回收率RSD均在正常誤差范圍之內(nèi)。

1   精密度和回收率測定(n=5

 

樣品

1質(zhì)量濃度?g/l

加標量ρ

g/l

1ρ

g/l

1回收量ρ

g/l

回收率%

RSD%

1

15.21

10.00

25.36

15.15

100.1

0.68

15.00

30.64

15.64

102.4

0.53

此外,對樣品還進行了分光光度法和HPLC法測定的對比實驗,以測定該法的準確度。將含有不同濃度110~100 g/l)的發(fā)酵液稀釋后分別按照2.22.3”項中方法分別進行測定。實驗結(jié)果表明,兩種方法的測量誤差在2%以內(nèi),進一步證明本測定方法不受發(fā)酵液中甘油雜質(zhì)的影響,具有相對較高的準確度。

 

2.9  發(fā)酵液中1濃度變化曲線的測定

按照“2.2”項中的方法,測定發(fā)酵液中1濃度變化曲線,并同時測定甘油的濃度變化(方法見“2.4”項),結(jié)果如圖4。從圖中可以看出,隨著發(fā)酵時間延長,底物甘油呈下降趨勢,在微生物分泌的酶作用下被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物1,108 h1產(chǎn)量達到64.5 g/l轉(zhuǎn)化率達到79.6%1/甘油,w/w。

 

 

 

  甘油轉(zhuǎn)化生成1曲線

3. 討論

本文建立了用2分光光度法測定甘油為底物的發(fā)酵液中1含量的方法。測定*波長選為608 nm,2*濃度為1%w/v水浴加熱時間14 min。該方法測定過程不受發(fā)酵液中甘油可溶性蛋白影響,具有顯色穩(wěn)定、測量快速準確的優(yōu)點,非常適合于生物發(fā)酵法生產(chǎn)1工藝中的產(chǎn)物測定。

 

結(jié)論:甘油為底物發(fā)酵液中二羥基丙酮的分光光度檢測方法??疾祜@色劑的用量、反應溫度、反應時間、顯色穩(wěn)定時間、發(fā)酵液成分發(fā)酵液中菌體自溶物等對測定的影響。該方法的相關系數(shù)R2=0.999,檢測范圍0.10.4 g/l,樣品回收率達102.4%,測定結(jié)果不受發(fā)酵液中甘油及其雜質(zhì)影響,具有快速準確的優(yōu)點。

 

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